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公 司:西安www.dafa股份有限公司
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产品选择指南  
                      凝胶过滤填料选择

去除内毒素
  内毒素也叫热源,一般是磷脂a、糖类和蛋白的复合分子,在中性条件下带有负电荷。
  内毒素的磷脂部分有很强的疏水性,在高盐情况下会聚合,所以很少用疏水色谱,如果蛋白本身的疏水性强,可以选择把目标蛋白结合到疏水色谱填料(苯基琼脂糖凝胶FF,丁基琼脂糖凝胶FF)上和内毒素分离。但是如果蛋白疏水性不强也可以尝试能不能挂内毒素而去除。
  内毒素带有很强负电荷,如果目标蛋白带阳电荷,用DEAE琼脂糖凝胶FF或Q琼脂糖凝胶FF把内毒素吸附,达到去除内毒素的目的。如果目标蛋白带阴电荷,可以尝试用阶段或梯度洗脱的方法把它们分离。
  其中最有效而特异的方法是用亲和色谱填料去除内毒素,为此我们专门开发了一种专门去除内毒素的色谱填料即去内毒素亲和填料FF和高效去内毒素亲和填料FF,配基为USP级别药品,填料为药品级别的材料,配基不脱落,安全性好,可以很方便去除内毒素,其使用简便,效果明显,样品回收率高,产品可以重复使用,成本低。已广泛应用于蛋白,抗体,核酸,病毒,多糖等产品的内毒素去除,可以做到<5EU/mg或ml,方法是把适量的色谱填料加到样品中4-25度震荡20-40h左右无菌过滤就可以得到热源符合要求的样品。配基是USP级别的药品,有专门结合磷脂a位点,在使用过程不脱落,安全性好,是常规方法失效后最有效去的方法。
去除核酸
  大量的核酸会使样品的粘度增加,影响传质从而影响分离效果,此外在药品检验中对核酸的含量也有严格的规定,所以去除核酸非常重要。
  核酸带有阴性的电荷,可用阴离子交换色谱填料DEAE-琼脂糖凝胶 FF或Q-琼脂糖凝胶 FF 去除,也可以用阳离子色谱填料:SP-琼脂糖凝胶 FF或CM琼脂糖凝胶 FF直接把目标蛋白吸附而去除核酸。它们属于最新一代的离子交换填料,载量高,分辨率好。在2-3M硫酸铵的条件下,RNA和DNA都可以被苯基琼脂糖凝胶FF吸附。
  此外也可以用核酸酶处理样品,把核酸降解成小片段,用琼葡糖凝胶FF凝胶过滤填料就可以去除。此外也可用DNA纯化琼脂糖凝胶FF去除。
去除病毒和微生物
  微生物和病毒是病原或者热源的来源,产生的酶也可能分解产物,因此要尽量去除干净。微生物可以通过严格的过滤方法控制,而病毒也可以用凝胶过滤去除,因为它们比普通的蛋白或核酸大,一般在外水体积全排阻。也可以在样品中加Triton和吐温后,再过CM或SP-琼脂糖凝胶 FF吸附目标蛋白得去除。配合各种色谱技术以及在位清洗和消毒都可以尽量减少这些病原体的污染。

生物大分子色谱纯化方法的选择思路

  通常在做纯化前对目标物质特性了解越多对纯化越有利,如果不很了解,也可以通过电泳知道目标物质和杂质的情况,在纯化前要建立一种简单可靠的鉴定和活性测定方法,如果是未知的物质,那么按以下几种简单的摸索:
  1. 离子交换色谱很常用,但是样品必须没有高浓度的盐。
  2. 凝胶过滤色谱,这个方法很常用。
  3. 疏水色谱也是不错的选择,它分离效率高,上样量大,特别适合分离盐析沉淀的样品。
  4. 亲和色谱是最有效的手段,关键要了解目标物质的特性以便选择合适的亲和色谱填料。
  5. 最后可以选择琼脂糖凝胶HP系列填料进行精细分离。
纯化硫酸铵沉淀样品
  硫酸铵沉淀是很常用的初分离的手段,这样沉淀后的样品可直接用苯基琼脂糖凝胶FF或者是丁基琼脂糖凝胶FF分离,不用除盐,非常方便。疏水色谱已经得到大规模的推广和应用,是很好的纯化的手段。此外疏水色谱也可以用于天然产物的分离纯化,包括多肽、色素等各种物质的分离纯化,它的分离原理和反相色谱,但是不同于硅胶色谱填料的是它对样品几乎没有死吸附,所以回收率高。
糖蛋白的纯化
  偶联凝集素的琼脂糖凝胶FF可以分离各种糖蛋白,例如Con A 琼脂糖凝胶 FF可以纯化糖基化的蛋白,或者膜组分,甚至细胞等物质。此外硼酸琼脂糖凝胶FF也用来分离各种多糖和糖蛋白,其原理是苯硼酸类似于凝集素可以和各种糖基上的邻二羟基发生亲和作用,通过降低pH或者竞争洗脱的方法就可以纯化各种糖和糖蛋白。
膜蛋白分离
  膜蛋白相对有比较强的疏水性,可以用苯基或丁基填料做疏水色谱分离,如果是有糖基结构或者受体等,也可以用亲和色谱的方法。没有现成的亲和填料可以用活化好的填料去合成,还可以结合离子交换和凝胶过滤等色谱手段进一步纯化。
纯化抗体和抗原
  重组蛋白A琼脂糖凝胶FF可以用于分离纯化各种来源的抗体,包括抗血清、培养液以及腹水等样品。蛋白A可以特异吸附IgG的Fc区,所以它也适合分离酶解后的Fc片段,把Fab片段和Fc段分离。同时蛋白A琼脂糖凝胶FF也可用于血清中IgG的分离,得到不含抗体的血清,重组蛋白A琼脂糖凝胶FF有很好的稳定性,能耐受37度3-5天而对柱子的性能没有影响,是分离IgG的最佳选择。
  疏水色谱色谱填料苯基琼脂糖凝胶FF、DEAE-琼脂糖凝胶 FF和球形羟基磷灰石FF也常用于抗体的分离,只是特异性不如重组蛋白A琼脂糖凝胶FF好。但是适用范围广,除纯化IgG外还可用于IgM、IgA和IgY的纯化,其条件温和,活性高,成本低,因此也不是不错的选择。
  纯化抗体或抗原最有效的办法是免疫亲和,具体的方法是把抗原或抗体直接偶联到各种活化填料上,然后直接高pH吸附,低pH洗脱就可以得到需要相应的抗原或抗体。
  对于特异而高亲和力的抗体筛选,特别是小分子的半抗原,建议可以把半抗原偶联到环氧活化填料,把只和抗原结合的抗体分离,得到高亲和力的抗体,非常方便和实用,此外也可以选择NH2- 琼脂糖凝胶 FF、HOOC-琼脂糖凝胶 FF或NHS活化琼脂糖凝胶 FF偶联半抗原,特别是对那些不适合用环氧活化琼脂糖凝胶FF偶联的半抗原。还可以选择醛基活化的填料(Aldehyde-Resin HP FF),它可以在中性条件下偶联带氨基及巯基物质或者CNBr 活化琼脂糖凝胶 FF,它们偶联效率高,条件温和,更适合连接抗体。如果要偶联的是小分子的物质,这些新型的填料避免由于蛋白彼此的位阻以及它和填料直接的位阻从而达到偶联同样配基密度而得到更高的载量,同时颗粒更小,表面积大,分离效果更好。对于带巯基的抗原也可以选择巯基活化琼脂糖凝胶去偶联,这样更容易保持抗原的活性。
  IgA 、IgM和IgY可用吡啶琼脂糖凝胶FF、苯基填料或亲和的方法把它们和杂蛋白分离。如果是免疫血清也可以直接过蓝色琼脂糖凝胶FF或者镍琼脂糖凝胶FF去除白蛋白,得到纯度不错的抗体,这样应用范围广,方便,比普通的沉淀方法快,收率高。此外也可以选择高分辨率的填料。
纯化重组蛋白
  重组蛋白构建已经考虑到纯化的问题,大大简化了纯化的步骤,但还是会遇到些实际的问题,所以需要详细阅读使用说明和注意事项。
  一、HIS标签重组蛋白可以很方便用镍琼脂糖凝胶FF或镍NTA琼脂糖凝胶FF分离,填料已经螯合好了镍离子,使用非常方便,有更高的吸附载量,特异性更强,可以选择多种洗脱方式,是纯化这类融合蛋白的最佳工具,也可以选择HP级别高分辨率的填料。最简单的是选择HIS纯化Kit,更方便简单.此外还提供经济型Ni-Resin HP填料,特别适合离心操作。
  二、GST融合蛋白在表达时同时表达了谷胱甘肽s转酶,很方便用GST琼脂糖凝胶FF分离,然后再用肠激酶或凝血酶等酶解就得到表达的产物。当然也可以选择GST纯化Kit,更方便简单。而凝血酶可以用肝素琼脂糖凝胶FF或苯甲脒琼脂糖凝胶FF分离。此外还提供经济型GST-Resin HP填料,特别适合离心操作。
  三、蛋白a融合蛋白可以用IgG琼脂糖凝胶FF分离。
包涵体蛋白的色谱复性
  离子交换和疏水色谱都在包涵体复性中有很好的效果,金属螯合色谱填料等亲和色谱填料也常用于带HIS标签融合蛋白的色谱复性。其中镍NTA琼脂糖凝胶FF更适合柱上复性,因为它可以耐受强的还原剂。
疫苗的纯化
  疫苗可以用琼脂糖凝胶6BFF或琼脂糖凝胶4BFF纯化。
DNA疫苗的纯化
  本公司开发了成套临床级别DNA疫苗纯化填料和工艺,提取后经硫酸铵沉淀,过琼脂糖凝胶6BFF可以去除RNA和蛋白,再用DNA纯化琼脂糖凝胶FF得到超螺旋DNA大于90%样品,载量3mg/ml左右,最后用去内毒素色谱填料去除内毒素就可做到临床级别的DNA疫苗,工艺简单,成熟,成本低,效率高。
球型羟基磷灰石FF也可以纯化DNA疫苗。
磷酸化蛋白和肽纯化
  金属螯合琼脂糖凝胶FF螯合铁或镓离子,可以特异吸附磷酸化的肽和蛋白,所以是分离这类物质最好的工具。
血清白蛋白去除
  蓝色琼脂糖凝胶FF可以用于分离各种激酶或依赖核苷酸为辅酶的酶,它很特异和白蛋白结合,所以用它去除样品中的血清蛋白的干扰,使样品更好纯化。PH4.5左右lml填料可以去除0.3ml血浆中的白蛋白,载量为16-20mg/ml。
  用镍琼脂糖凝胶FF也可以和白蛋白结合,载量为16mg/ml。
多肽纯化
  配合离子交换和琼葡糖凝胶G25系列,可以纯化各种多肽,也可以用苯基琼脂糖凝胶,这样粗分后再用HPLC去制备,可以增加上样量,提高效率,减轻HPLC负担。此外可以选择Resin 30HP这系列的填料,载量高,分离效果好。
病毒纯化
  用DEAE或Q琼脂糖凝胶FF富集和分离后再上琼脂糖凝胶6BFF可以得到纯的病毒,当然也可以先过琼脂糖凝胶6BFF再过DEAE或Q琼脂糖凝胶FF,这样得到的病毒滴度更高。
DNA纯化
  大提完的质粒可以过琼脂糖凝胶6B FF,去盐和RNA及蛋白。非常方便,而且能重复使用。比普通试剂盒效果好,如果配合RNA酶或硫酸铵沉淀,效果更好。
DNA结合蛋白的纯化
  用DNA琼脂糖凝胶可以专门纯化和DNA结合的蛋白,也可以用肝素琼脂糖凝胶去纯化。
带巯基的物质的的纯化
  用巯基活化琼脂糖凝胶可以很好共价吸附,洗去杂质后再用DTT可以很方便把这类物质洗脱,它也可以用于固定各种巯基物质合成亲和填料。
脱盐或交换缓冲液
  病毒、DNA疫苗或质粒可以用琼脂糖凝胶6BFF除盐或交换缓冲液,蛋白、抗体等可以用琼葡糖凝胶G15FF或葡聚糖凝胶G25快速去盐和交换缓冲液,前者适合分子量大于3000以上物质的,应用范围比普通的sephadex G25更广。本公司开发一种标记盐的指示剂,在除盐样品中添加1%左右,可以看到盐部分的红色颜色,这样不需要测电导,也不需要专门的机器就只收集没有颜色的部分就可以除盐,非常方便,快捷。我们提供各种除盐用的大发国际网址。
在位消毒和清洗
  在位消毒和清洗对色谱填料应用和保养是非常重要的,其中在位消毒可以将病原微生物的污染降低到最低水平,通常用0.5-1M NaOH以合适的流速消毒1-2个小时,在位清洗是清除填料或柱子中的沉淀及未洗净物质,一般填料用10次后至少需要做1次这样的操作,具体操作和位消毒一样,做在位清洗或消毒都可以互相代替,无须做两步都做。具体方法为:
  1. 离子交换,凝胶过滤,疏水色谱填料可以用1M以NaOH以30cm/h反向冲洗3-5个柱床体积,然后再用3-5个柱床体积的平衡缓冲液再生即可。
  2. 去除疏水性强的杂质一般方法是先用纯水洗3个柱床体积,然后再用70%的乙醇或30%的异丙醇含0.5%的Triton或吐温洗5-10个柱床体积,然后用纯水洗3-5个柱床体积即可。对于离子交换柱子上吸附的色素可以用0.2-0.5M醋酸洗3-5个柱床体积。
线流速和流速换算
  不同规格的柱子通常流速(ml/min)很难比较,一般需要换算成线流速再做比较,计算公式为:线流速=流速(ml/min)x60/柱子半径(cm)平方x圆周率(π)。

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